植物总RNA的分离

2020-02-17 网友贡献 ibioo.Com
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 实验概要

认识真核生物RNA的组成及分离的原理;学习RNA提取过程中抑制RNA酶活性的方法。

 

实验原理

真核生物的RNA包括rRNA、tRNA和mRNA。一个典型的真核细胞约含有10-5~10-6mg的RNA,其中80-85%为rRNA,其余15-20%主要由各种低分子量RNA组成(如tRNA、核内小分子RNA等),细胞的RNA大多都与蛋白质结合在一起,但这种结合很容易在变性剂存在下打破。在经有机溶剂抽提后,用乙醇或异丙醇可将其从上清中沉淀出来。

RNA提取中要严格避免RNA酶的污染,因为RNA酶极稳定,通常的消毒方法难以将其灭活,而空气中细菌、真菌和操作者都有可能成为RNA酶的污染源。RNA酶污染会使分离的RNA大量降解。

对于rRNA和tRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列,当总RNA分离出来后还能用电泳、密度梯度离心、层析等方法加以进一步分离纯化。而mRNA的分离将在后续实验中做到。

 

主要试剂

1. 异硫氰酸胍

2. CSB(柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/b-巯基乙醇)缓冲液

3. 2mol/L NaAc pH 4.0

4. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)

5. 异丙醇

6. 75%乙醇

7. DEPC H2O等

主要设备

1. 瓷研钵(组织捣碎机)

2. eppendorf离心管

3. 冷冻台式离心机

4. 液态氮

5. 剪刀

6. 一次性手套

7. 恒温水浴锅

8. 真空干燥仪

9. 紫外分光光度计

10. 凝胶电泳装置

11. 凝胶成像系统等。

进行RNA提出的所有器皿必须保证未受RNA酶的污染,玻璃、瓷器和金属耐热器皿应先以0.1%DEPC(二乙基焦碳酸盐)水溶液浸泡2hr,然后以铝箔包裹后在180℃烘烤过夜。使用新的塑料制品,并将其在0.1%DEPC中浸泡2hr并经高压蒸汽消毒30min。操作过程中还应严格避免外源RNA酶的污染。

 

实验材料

水稻幼苗,剪取幼芽。

 

实验步骤

1. 称取材料0.1g,剪成约2mm长段,加入液氮研磨成细粉状。

2. 加入0.2g异硫氰酸胍和2ml CSB缓冲液,继续研磨成匀浆。

3. 将匀浆转移至两个eppendorf管中,加入0.12ml NaAc,加盖后反复颠倒离心管20次。

4. 每管加入1ml酚:氯仿:异戊醇,混匀后剧烈震动10sec,冰浴15min。

5. 10,000g,4℃离心15min。

6. 小心将上层水相转移至新管中,注意不要吸动中间层。中间层富含蛋白质和DNA。

7. 加入等体积的异丙醇,混匀后置-20℃放置30min以沉淀RNA。

8. 10,000g,4℃离心20min沉淀RNA。

9. 弃上清,将RNA沉淀悬浮到0.5ml CSB溶液中,摇动溶液至RNA溶解。

10. 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇重新抽提一次,即重复4—8的步骤。

11. 离心后弃上清,沉淀用0.5ml预冷的75%乙醇漂洗一次。离心后弃上清,真空初步干燥沉淀。

12. RNA溶解在0.2ml  DEPC水中,用紫外分光光度计测定260nm、280nm、及230nm波长的光密度,获得RNA的浓度和纯度。

 

注意事项

1. RNA的浓度C=A260×40×测定稀释倍数(ug/ml),纯RNA的A260/A280比值在1.7-2.0之间,若低于该值范围,表明有蛋白质污染,应重新进行有机溶剂抽提。若高于该范围,可能有异硫氰酸胍的残留或有核酸的严重降解,应重新进行醇沉淀的步骤。

2. 当前有很多生物技术公司生产分离RNA的试剂盒,如Trizol试剂,将异硫氰酸胍、CSB及苯酚混合在一起,按一定的体积与材料研磨后,即可通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA,可很方便地进行RNA的分离。