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RLM-RACE法合成双链cDNA

  

 实验试剂

 

1. 酶类及分子量标准

   1)  高保真酶Easy-A high fidelity cloning enzyme,Merck公司Stratagene系列;

   2) Taq DNA Polymerase,上海申能博彩生物技术有限公司;

   3) DL 2000 DNA Marker,宝生物工程(大连)有限公司。

2. 主要试剂(盒)

   1) GeneRacerTM Kit,美国Invitrogen公司;

   2) SuperScriptTM II Reverse Transcriptate,美国Invitrogen公司;

   3) dNTP,上海申能博彩生物技术有限公司;

   4) 其他试剂为国产分析纯。

 

实验设备

 

1. MDF-192型超低温冰箱,日本三洋电机株式会社;

2. CF43S超净工作台,Gelman公司;

3.  高速冷冻台式离心机,Heraeus Sepatech公司;

4. Capsule HF-120型微量离心装置,Millipore公司;

5. BL150S型电子天平,德国Sartorius公司;

6. GB 1302型天平,Mettler-Toledo仪器(上海)有限公司

7. YXQ.WY21-600IIR卧式高压蒸汽消毒器,广州市医疗设备厂;

8. DYCD-31D型水平电泳槽,北京六一仪器厂;

9. EPS1001型电泳电源,Amersham Pharmacia公司;

10. 连续可调微量移液器,德国Eppendorf公司;

11. Primus 25型PCR基因扩增仪,德国MWG公司;

12. AlphaImager 2200型凝胶图像分析系统,Alpha Innotech公司;

13. XK96-B微型旋涡混合仪,江苏省姜堰市新康仪器厂。

 

实验材料

 

无菌感染期线虫RNA

 

实验步骤

 

1. 总RNA双链cDNA的合成

按照GeneRacerTM Kit 说明书的方法RLM-RACE法合成双链cDNA 。

2. RNA脱磷酸

   1)  脱磷酸反应

        A. 在无菌的1.5 mL离心管中依次加入下列组分建立反应体系(冰上操作):

 

Total RNA

3.6 µL

 

 

10×CIP Buffer

1 µL

 

 

RNaseOutTM (40U/µL)

1 µL

 

 

CIP (10U/µL)

1 µL

 

 

DEPC water

3.4 µL

 

 

Total Volume

10 µL

 

 

        B.  轻混反应物,微漩涡,微离,50℃温育1 h,微离后置于冰上。

   2)  沉淀RNA

        A.  在上述反应液中加入90 μL DEPC H2O和100 μL酚/氯仿,漩涡混匀 30秒;

        B.  室温18000 rpm高速离心5 min;

        C.  小心吸取上层水相到一新的离心管内;

        D.  加入2 μL(10 mg/mL)mussel glycogen ,10 μL 乙酸钠(3 M,pH 5.2),温和混匀,再加入220 μL 95%乙醇,微漩涡混匀;

        E.  置于-80℃,10 min;或-20℃过夜;

        F.  4℃条件下,18000 rpm离心20 min,获得沉淀的RNA;

        G.  小心吸弃上清液,加入500 μL 70%乙醇,上下颠倒混匀,再微漩涡;

        H. 4℃,18000 rpm离心2 min,吸弃上清,再离心几秒,用移液器彻底除去乙醇,风干;

        I.  沉淀溶于8 μL DEPC H2O中,取1 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3. mRNA脱帽

   1) 脱帽反应

       A. 在无菌的1.5 mL离心管中依次加入下列组分建立反应体系(冰上操作):

 

脱磷酸RNA

7 µL

 

 

10× TAP Buffer

1 µL

 

 

RNaseOutTM (40U/µL)

1 µL

 

 

TAP (40U/µL)

1 µL

 

 

Total volume

10 µL

 

 

        B.  轻混反应物,微漩涡,微离,37℃温育1 h,微离后置于冰上。

   2)  沉淀RNA

方法同1中2)

4. 脱帽mRNA与RNA Oligo的连接

   1)  连接反应

        A. 加7 μL脱磷酸、脱帽的RNA至GeneRacerTM RNA Oligo中,用吸头混匀,微离收集液体;
        B. 65℃温育5 min,冰上致冷,微离;

        C.  在管中依次加入下述组分建立反应体系:

 

10× Ligase Buffer

1 µL

 

 

10 mM ATP

1 µL

 

 

RNaseOutTM (40U/μL)

1 µL

 

 

T4 RNA Ligase (5U/μL)

1 µL

 

 

Total volume

10 µL

 

 

        D. 37℃温育1 h,微离,冰上致冷。

   2)  沉淀RNA

方法同1中2),最后加11 μL DEPC H2O,取1 μL进行电泳检测。

5. 反转录第一链cDNA

   1)  依次加入下述组分于上述10 μL连接体系中:

 

GeneRace Oligo dT Primer

1 µL

 

 

dNTP Mix

1 µL

 

 

RNaseOutTM (40U/μL)

1 µL

 

 

   2) 65℃温育5 min,冰上致冷2 min,微离;

   3) 依次加入下述组分于上述13 μL混合体系中:

 

5× First Strand Buffer

4 µL

 

 

0.1 M DTT

1 µL

 

 

RNaseOutTM (40U/μL)

1 µL

 

 

SuperScriptTM III RT (200U/μL)

1 µL

 

 

Total volume

20 µL

 

 

   4) 吸头混匀,微离,50℃温育1 h;

   5) 70℃,15 min终止反应,冰上冷却2 min,微离心(室温,18000 rpm);

   6) 混合反应物中加入1 μL的RNase H(2 U), 37℃温育20 min;

   7) 微离,直接用于PCR扩增或-20℃贮存。

6. PCR扩增dscDNA

以反转录第一链cDNA为模板,按以下组分,建立PCR反应体系:

ddH2O

36.5 µL

 

10×PCR buffer

5 µL

 

dNTP Mix (10 mmol/L)

1 µL

 

GeneRacerTM 3’ Primer (10 µmol/L)

3 µL

 

GeneRacerTM 5’ Primer (10 µmol/L)

3 µL

 

RT template

1 µL

 

Easy-A high fidelity cloning enzyme

0.5 µL

 

Total volume

50 µL

 

充分混匀,按以下程序进行PCR扩增:95℃热变性2 min,迅速加入高保真酶,再94℃变性2 min进入循环,94℃变性30 秒,65℃退火30秒,68℃延伸2 min,25个循环后于68℃继续延伸10 min。扩增产物以琼脂糖凝胶电泳检测,置于-20℃保存备用。

相关参考
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