返回首页

如何选择正确的反转录方法

  

 逆转录PCR(RT-PCR)在实验室中经常被用于检测和量化样本中的RNA表达。实验的第一步是通过逆转录(RT)将不稳定的RNA转化为互补的DNA(cDNA)。实际上,RT是许多用于研究RNA的分子生物学技术的第一步,因为将不稳定的RNA转换为更稳定的DNA会使分析更容易、更可靠。对于RT-PCR,有一步法和两步法。

pcr-method

 

在一步法RT-PCR中,RT反应和PCR扩增是在同一管中进行。将RNA模板添加到试管中,加有两种酶(逆转录酶和DNA聚合酶),以及完成反应的所有必须组分。逆转录酶产生cDNA产物,然后逆转录酶和cDNA变性,DNA聚合酶扩增cDNA。在一步法中,RT反应由基因特异性引物启动。因此,只有感兴趣的区域被反向转录,然后进行扩增。

 

在两步法RT-qPCR中,RT反应与PCR扩增单独进行。首先,RNA添加到反应混合物中,混合物包括逆转录酶和oligo-dTs (结合mRNA的poly-A尾巴)或随机六聚体(或两者都有),合成cDNA。下一步,从管子中取出少量cDNA,置于一个新管中,作为PCR的模板与基因特定的引物一起混合。因为RT反应采用随机启动或由oligo-dTs进行启动,总RNA或总mRNA在RT步骤中被转录。

 

尽管这两种方法都能得到最终的结果,但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。

 

一步法RT-PCR

 

优点: 只需一步,反应发生在单管中,速度比两步法更快,而且需要较少的准备和操作时间。

处理大量样品时易于操作,减少污染的机会。

整个cDNA样品都被扩增,灵敏度更高。

 

缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性,因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。

 

适用性:当时间对于实验很重要时,一般采用一步法。例如,迅速的一步法是RNA病毒检测的好方法,结果可以很快得到。也适用于高通量分析。 由于该方法采用基因特异性引物,所以通常是分析低表达水平基因的较好选择。此外,一步法是非常精确的,需要测量表达水平上的细微差异时这是一种常用的方法。

 

两步法RT-PCR

 

优点: 可以分析同一样本的多个目标。

逆转录步骤将样本中所有的RNA转换为cDNA,可以储存cDNA用于后续实验,检测大量基因。

能够分别优化RT和PCR步骤,可以更好地控制实验过程。

因为只有少量的转录材料用于PCR,任何可能从RNA分离到RT反应的抑制剂(如乙醇、苯酚

或胍盐)都被稀释了。

 

缺点:它更耗费时间,且带来污染的可能性更高。RT步骤转录所有的RNA以相同的效率,选择这种方法时,应该考虑到启动会影响qPCR的结果。例如,以oligo-dTs 和随机六聚体启动反应可能会带来不同的结果。因此,对于每个RT反应应该使用相同的条件。

 

适用性:选择两步方法的最常见原因是对同一样本的多个目标进行分析。第二,当RNA的存储是个问题时,最好是进行两步RT-PCR,因为cDNA在-20°C是稳定的。此外,当起始材料有限时,使用两步RT-PCR ,通常会有更高的cDNA产量。

方法 反转录
相关参考
------分隔线----------------------------
推荐内容
关注微信
Ads