qRT-PCR实验

2020-02-17 北京干细胞库 北京干细胞库
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 实验概要

实时定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前,实时定量PCR所使用的荧光化学组分一般可分为两种:荧光探针和荧光染料。
1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变,如单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2)SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
本部分将以SYBR荧光染料为例介绍qRT-PCR的操作方法。

主要试剂

SYBR Green、H2O、特异引物

主要设备

200 μL八联管

实验步骤

①根据干细胞特异基因的mRNA设计引物,并送交引物合成公司合成。②提取RNA:使用TRIzol®试剂,参照厂商产品说明书。
③cDNA合成(Reverse Transcription, RT):市场上有很多商业化试剂盒,参照厂商产品说明书。
④确定上机内容,在记录本上编排好上机的样品排放顺序。
注意:实验中,一个样品的加样尽可能安排在同一行。另外,正式实验中三次重复不能安排在同一板上,需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板。
⑤配制qPCR反应体系:

成分 单份剂量 终浓度
2×SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 7.5 mL
引物混合物 (10 mM) 0.6mL 0.4 mM
cDNA模板 X mL 不超过总反应体系的10%;可做系列稀释来确定优化用量。
H2O 加至15 mL  
⑥循环(根据不同的扩增片段和引物调整循环的条件):95℃ 2 min;95℃ 10 s, 55℃ 15 s, 72℃ 10 s, 循环40次;95℃ 1 min, 60℃ 30 s, 95℃ 30 s。