实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化

2011-12-26 admin ibioo.Com
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时荧光定量PCR以其精确、快速、方便,越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对精确性要求很高的实验,不仅要求在实验前有比较完整的实验设计方案,而且实验的条件对实验结果的影响也非常大。这些都是很多老师与学生非常关心的问题,下面分别从这两个方面来对定量PCR实验做一些阐述。
定量PCR实验步骤(以mRNA为例):
1.设计实验方案:例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计
2.引物和探针的设计和合成
3.抽提RNA,测定提取的RNA的浓度
4.反转录PCR
5.定量PCR
6.数据分析
在进行定量PCR实验的过程中,PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素,因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率最大值1,因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的精确性及重复性,影响PCR扩增效率主要有以下几个方面:1,扩增子的长度;2,扩增子的GC含量;3,扩增子、引物和探针的二级结构;4,PCR反应各组分的浓度;5,RNA或者cDNA的纯度。
进行定量PCR实验时,必须设计好引物和探针,除了能获得高的扩增效率外,对PCR扩增的特异性、消除基因组DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。下图就是使用不同的引物和探针对18SRNA进行定量PCR的荧光曲线图(反应条件和模板都相同)。

引物设计原则:
1.上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段,必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守。
2.上下游引物的长度一般为18-30bp之间,且Tm值在58-62℃之间,上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3.确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构,同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。5.跨外显子设计引物,用于区别或消除基因组DNA的扩增。

探针设计的基本原则:
1. 保守:探针要绝对的保守,有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对,就可能检测不出来。