连续梯度法纯化闭环DNA

2020-02-17 网友贡献 ibioo.Com
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实验概要

 

本实验介绍了氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法(即连续梯度法)纯化闭环DNA的原理及操作步骤等。

 

实验原理

 

用含氯化铯和溴化乙锭的悬浮密度梯度离心法分离质粒和染色体 DNA 的方法,取决于线性 DNA 和闭环 DNA 结合的溴化乙锭的量的差异。
许多年来,纯化大量质粒 DNA 的首选方法是 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法.但由于这种方法耗时费钱,于是发展了许多其他方法,包括差异沉淀法和柱层析法.尽管如此,许多坚持传统的人仍然认为,用 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法纯化的质粒 DNA 是最纯最好的.由于用 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法纯化的闭环 DNA 有宿主菌的小片段 DNA 和 RNA 的污染,这些小片段比质粒 DNA 需要更长的是 ianzaiCsCl- 溴化乙锭梯度中达到平衡.因此当闭环 DNA 达到平衡时,小片段分子仍在不同梯度均与分布.这一问题可以通过一些两种办法来解决:采用商品化的树脂柱层析法取代 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法,或将 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心得到的闭环质粒 DNA 进行第二轮 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心。 
另一种方法称为不连续 CsCl 梯度离心法: CsCl 溶液在离心管中按三种不同浓度分层排布,经离心,CsCl 梯度的形成更可,离心时间缩短到 6h。但是,不连续 CsCl 梯度离心法将闭环质粒 DNA 与染色体及开环质粒 DNA 分离的效果不如连续梯度离心法。
在下述连续梯度离心中,将溴化乙锭和粗制质粒 DNA 与密度约为 1.55 的 CsCl 溶液混匀.当混合物以高速离心时,离心力足以产生并维持铯离子的梯度.在梯度形成过程中,不同浮力密度的 DNA 进入与其带有相同密度的 CsCl 层.欲达平衡梯度,以往需要离心 24-28h;但由于现代的垂直管转头离心力高,直径小,因而其梯度的形成比用旧事的低速固定角度的转头快的多。

 

主要试剂

 

1. CsCl (固体)

2. CsCl 再分带溶液

3. 乙醇

4. 溴化乙锭( 10mg/ml )

5. 石蜡油

6. 核酸和寡核苷酸

7. 粗制质粒

 

主要设备

 

1. 离心机和转子,Sorvall-SS34 或与其相当的转头

超速离心机转头(最好用垂直式)和离心管,如果离心时间不是限制因素,可用 Beckman Vti65、角度专题 Ti50、 Ti65、 Ti70或Sorvall的相当产品.使用可快封的 polyallomer 管或相当产品。 
2. 皮下注射针头( 21 号)

3. 巴斯德吸管或配大口径针头的一次性注射器
4. 折光仪(可选),尽管并非必需,折光仪在估计 CsCl 溶液密度时十分有用
5. 带有 18 皮下注射针头的一次性注射器(5-10ml ,无菌)

 

实验步骤

 

1. 测定粗制质粒 DNA 的量。最好通过向一个已在天平上调零的洁净管中加入溶液来测定,每克质粒 DNA 溶液中准确加入 1.01g 固体 CsCl ,闭上管盖以防蒸发,于 30℃温育促使 CsCl 溶解.轻轻混合溶液直到 CsCl 溶解。 
每个梯度的 DNA 用量宜来自不超过 50ml 过夜培养物的粗提质粒。因为 Beckman Vti65.2 转子的垂直离心管只可容纳约 5mlCsCl- 溴化乙锭溶液,所以来自 50ml 培养物的粗提质粒 DNA 应重溶于约 3mlTE ( ph8.0 )中。 
2. 向每 5gDNA 原液中加入 100ul 10 mg/ml 的溴化乙锭溶液。
溶液的终密度应约为 1.55g/ml,(折射率为 1.3860 ),溴化乙锭的浓度约为 200ug/ml。以往曾认为,欲使溴化乙锭与闭环 DNA 和线状 DNA 的结合达饱和,大剂量的溴化乙锭是必需的,所以溴化乙锭的用量要大得多。然而,由于高浓度未结合的溴化乙锭可能会使微弱的 DNA 区带模糊不清以致在紫外线下才能看到.因而近年来成功使用低浓度的溴化乙锭,使得 DNA 区带在可见光下显现.不过当含有低浓度溴化乙锭的梯度载有过量核算时,又会出现问题:在这种情况下,可能没有足够的溴化乙锭与闭环 DNA 和线状 DNA 达饱和结合。因为在 CsCl- 溴化乙锭梯度中大多数溴化乙锭不是与 DNA 而是与存在于粗制质粒 DNA 的细菌 RNA 结合,所以在超速离心之前用不含 DNA 酶的 RNA 酶处理粗制品,此问题可予解决。如果来自 50ml 细菌培养物的粗提质粒 DNA 用 3ml TE ( ph8.0 )重溶,再用来制备一个 5ml 的 CsCl- 溴化乙锭梯度,则该处理通常不是必需的。
3. 如果使用 Corex 玻璃管,将溶液于温室用 7700g(8000r/min,Sorvall-SS34 转子 ) 离心 5min ;如果使用一次性聚丙烯管,则用 1100g ( 3000r/min,Sorvall-SS34 转子 ) 离心 10min。
浮在离心管顶部的暗红色渣滓是溴化乙锭和细菌蛋白形成的复合物,离心管底部的沉淀是宿主菌被 SDS 和(或)热裂解而产生的碎片.当宿主菌被 SDS 或煮沸裂解时常会遇到这些棘手的问题,而用碱裂解法产生的碎片 iaoshao。
4. 用巴斯德吸管或带大号针头的遗传学注射器将浮渣之下,沉淀智商的清亮红色溶液转移到适用于超速离心转子的离心管中,用轻石蜡油或重新分层溶液加满该离心管.离心时确保转子中离心管重量的平衡。按照厂家说明密封离心管。
5. 用适当的转子与 20 ℃进行密度梯度离心。 
Beckman NVT65 转子 366000 ( 62000r/min ) 6h 
Beckman VTi65 转子 194000 ( 45000r/min ) 16h 
Beckman Type 50Ti 转子 180000 ( 45000r/min ) 48h 
Beckman Type 65Ti 转子 314000 ( 60000r/min ) 24h 
Beckman Type 70.1Ti 转子 331000 ( 60000r/min ) 24h 
6. 离心结束后,从离心机上轻轻取下转子水平放置.小心取出每个离心管,放于附有锡箔的试管架上.在仅有微光的室内(即关闭头顶的日光灯),将离心管放在铁架台的铁箍上。
在普通光找下,于梯带中心可见两条 DNA 区带,上层区带的内含物通常较少,由线状的细菌(染色体) DNA 和带切开的环状质粒 DNA 组成:下层区带则有闭环质粒 DNA 组成.管底的深红色沉淀是溴化乙锭和 RNA 的复合物,位于 CsCl 溶液和石蜡油之间的物质是蛋白质。
如果质粒 DNA 的产量较低,可用手提式长波紫外灯检测离心后的 DNA ,可将其与含有分离好的 DNA 的离心管装在同一铁架台的铁箍上.紫外灯照射的离心管上可使溴化乙锭和 DNA 的复合物发出明亮的橘红色荧光,有助于用针头或注射器将其吸取.如使用紫外灯,引物质粒 DNA 过度暴露于紫外线下会遭破坏,故应尽快收获质粒 DNA .此外,应带上面罩以防眼睛受到紫外灯伤害.虽然长波紫外线照射引起的伤害较短波小,但依然能够损伤眼睛。
7. 收集闭环 DNA 区带。
   1)用 21 号皮下注射针头在离心管顶端扎一个小孔以使液体被吸出空气能进入。 
   2) 用乙醇小心擦拭离心管外壁以除去任何油脂,然后用一块 Scotch 胶带或 Time 较大贴于管外壁。胶带起密封作用以减少针头穿刺后的泄露。 
   3) 将一个 5-10ml 的一次性注射器装上一个无菌的 18 号皮下注射针头,将针头斜面向上地穿过胶带插入管中,以使针头的斜面开口正好位于较低的 DNA 区带(闭环质粒 DNA )的下方。 
   4) 缓慢吸出质粒 DNA ,小心不要搅动上方黏稠的染色体 DNA 区带。 
欲避免染色体 DNA 的污染,不要试图从梯带中移去每一点可见的痕量闭环质粒 DNA 。 
有些研究者喜欢移去较低的闭环质粒 DNA 区带之前先去除较上方的 DNA 区带。此法不太可取,这是因为位于较上层的黏稠的高分子质量染色体 DNA 能缠绕住闭环质粒 DNA 并将其带出离心管。 
8. 从 DNA 中去除溴化乙锭。
为了减少闭环 DNA 区带中染色体 DNA 和 RNA 片段的污染,可将闭环 DNA 重新分层。欲使质粒 DNA 重新分层,应将注射器中的内含物缓慢转移至一个新的可快速密封的 polyallomer 离心管中,在装满 CsCl 重分区带溶液。密封离心管,再次离心,用如上所述步骤 5-7 回收闭环质粒。从 DNA 中去除溴化乙锭。