从动物组织提取基因组DNA

2020-02-17 网友贡献 ibioo.Com
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实验概要

本实验以哺乳动物新鲜组织为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。

 

实验原理

 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。

 

主要试剂

1. 分离缓冲液:10mmol/L Tris·Cl pH7.4,10mmol/L NaCl,25mmol/L EDTA。

2. 10% SDS

3. 蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)

4. 乙醚

5. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)

6. 无水乙醇及70%乙醇

7. 5mol/L NaCl

8. 3mol/L NaAc

9. TE等

 

主要设备

1. 移液管

2. 高速冷冻离心机

3. 台式离心机

4. 水浴锅

 

实验材料

哺乳动物新鲜组织。

 

实验步骤

1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。

2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。

3. 加1ml 10% SDS,混匀,此时样品变得很粘稠。

4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K,37℃保温1-2小时,直到组织完全解体。

5. 加1ml 5mol/L NaCl,混匀,5000rpm离心数秒钟。

6. 取上清液于新离心管,用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。

7. 取上层水相至干净离心管,加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8. 移去上层乙醚,保留下层水相。

9. 加1/10 体积3mol/L NaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。

10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl),37℃保温30分钟,用酚抽提后,按步骤9-10重沉淀DNA。