小量制备质粒DNA(强碱法)

2020-02-17 网友贡献 ibioo.Com
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实验概要

本文介绍了强碱法小量制备质粒DNA的原理及操作流程。有助于了解基因工程操作中运载基因的载体,掌握最常用的提取质粒DNA的方法。

 

实验原理

碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、膜,释放出胞内染色体DNA,质粒DNA及其它物质,通过一系列的纯化过程:高盐除核DNA,苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类,最后用异丙醇(或乙醇)沉淀出质粒DNA和RNA等, RNA再经RNase消化,得到质粒DNA,这种质粒DNA可用作基因工程的载体,更广泛地用于重组子的鉴定。

 

主要试剂

1. 溶液1(GTE)    

50 mmol/l       葡萄糖

10 mmol/l        EDTA-Na2

25 mmol/l        Tris-Cl  (pH 8.0)

4mg/ml           溶菌酶

2. 溶液2   

200 mmol/l       NaOH

1% SDS

3. 溶液3   

5 mol/l KAC    60 ml

冰乙酸        11.5ml

ddH2O         28.5ml

4. 苯酚-氯仿

5. 异丙醇(或95%乙醇,100%乙醇)

6. 70%乙醇

7. TE (pH 8.0):  

10 mmol/l   Tris-Cl (pH 8.0)

1 mmol/l    EDTA-Na2

8. RNase  1mg/ml       

9. Amp   100ug/ml

 

主要设备

1. 37℃摇床

2. eppendorf管

3. 高速离心机

4. 低温冰箱

 

实验材料

Ecoli InvaF'(pUC19)

 

实验步骤

1. 挑取一单菌落的Ecoli InvaF'(pUC19)菌种接种到含Amp100ug/ml的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。

2. 吸1.4ml菌液至eppendorf管中,在高速台式离心机上5,000g离心2min,倒去培养基。

3. 重复1次,尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上,以吸干管壁上残留的培养基,收集细菌。

4. 将细菌悬于500ul冰冷的溶液1中,于离心机上5,000g离心2min。

5. 倒去溶液1,再悬于200ul冰冷的溶液1中。

6. 加入300 ul新配制的溶液2,冰浴5 min。

7. 加入300ul冰冷的溶液3,中和,轻轻振荡10sec,至冰浴5 min。

8. 于离心机上,10,000 g离心5min。

9. 取上清转移至一新管中,并加入RNase酶至50ug/ml,于37℃水浴中温浴30 min。

10. 加入等体积的饱和酚抽提1次,10,000 g离心5min取上清液。

11. 再加入等体积的氯仿抽提1次, 10,000 g离心5min取上清液。

12. 加入750ul异丙醇,沉淀质粒DNA, 10,000 g离心10min。

13. 倒去异丙醇,用70%乙醇洗涤沉淀,10,000 g离心5min。

14. 置冰箱内开盖干燥,悬浮至40ul去离子水或TE中。