耐药质粒DNA的转化

2020-02-17 网友贡献 ibioo.Com
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 实验概要

 本实验介绍了将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆,即转化子。

 实验原理

 受体菌Ecoli RRI 在低温条件下经Ca 处理,可改变细胞膜的通透性,利于受体菌对DNA的摄取,这种经Ca 处理的细菌称感受态菌。pBR322 质粒带有氨基苄青霉素(Ap)和四环素(Tc)基因,如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌体内,则可使该细菌获得Apr和Tcr,表现出对Ap和Tc的抗药性。

 

主要试剂

 1.LB 液体培养基 
2.75mM CaCl2

3.氨苄青霉素琼脂平板(50ug/ml)

 

主要设备

 1.灭菌小试管

2. 刻度吸管

3. 微量加样器

4. 离心机

5. L形玻璃棒

 

实验材料

 1.菌株 E.coli RRI

2.pBR322 质粒DNA, 
3.感受态菌75mmol CaCl2

 

实验步骤

 1. 感受态菌的制备

   1) 将细菌接种于5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养16~20h。
   2) 取新鲜菌液,按1/100的接种量接种于LB培养基中,37℃振荡培养2~3h。
   3) 取1.5ml菌液,4℃ 3000rpm/min,离心5min,弃上清。
   4) 菌体沉淀加入750μl预冷的(4℃)75mmol/L CaCl2 溶液,轻轻吹打菌悬液,放冰浴30min。
   5) 4℃3000rpm/min,离心5min,弃上清。 
   6) 菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCl2溶液,冰浴4min以上。4℃保存备用。 
2. 质粒转化 
   1) 取2个洁净,灭菌的EP管,加入各成分。        
   2) 上述2个试管充分混均匀后,置冰浴30min。 
   3) 42℃2min或37℃5min,立即置冰浴2min。
   4) 加入1ml LB肉汤培养基,37℃静止培养1h。

3. 转化子筛选
   1) 取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板(50ug/ml)上,对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上,每块板涂0.1ml,用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置37℃培养过夜,观察转化结果。
   2) E.coli 受体菌不含有质粒DNA,也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落,可初步确定受体菌获得了耐药性质粒,然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。